Zartan (Arnold Vosloo) vom Cobra Kommando hat erfolgreich durch den Einsatz der Nanomite-Technologie die Gestalt des amerikanischen Präsidenten (Jonathan Pryce) angenommen und so die Regierung erfolgreich infiltriert. Als erste Amtshandlung erklärt er die G.I. Joes zu Staatsfeinden und ihnen den Krieg. So werden Captain Duke (Channing Tatum), seine Leute und der Veteran unter den G.I. Joes, Roadblock (Dwayne Johnson), trotz ihrer zahlreichen Verdienste zu Gejagten von Zartans Truppen unter den Verbündeten Storm Shadow (Byung-hun Lee) und Firefly (Ray Stevenson). Im Kampf um die Zukunft der Menschheit erhalten Duke und Roadblock jedoch unerwartete Hilfe von der Legende selbst, General Joseph „Joe“ Colton (Bruce Willis). Gemeinsam schlagen sie zurück…