Die Zeiten, in denen sich Vampire und Lykaner im Untergrund einen erbitterten Kampf lieferten, sind offiziell vorbei. Die Menschen haben die beiden Spezies längst entdeckt und an den Rand des Aussterbens gebracht. Rund zwölf Jahre nachdem Vampir-Aktivistin Selene (Kate Beckinsale) während der ethnischen Säuberung gefangengenommen wurde, erwacht sie in einem Labor des mächtigen Biotec-Konzerns Antigen und ergreift die Flucht. Sie ist geschockt, als sie erfährt, dass ihr Geliebter, der Mensch-Lykaner Michael (Scott Speedman), tot sein soll. In den Korridoren des Antigen-Konzerns, in dem Dr. Jacob Lane (Stephen Rea), sein Sohn Quint (Kris Holden-Ried) und ihre Mitarbeiter vermeintlich das Virus bekämpfen, das Vampire und Lykaner erschaffen hat, stößt Selene überraschend auf ihre Tochter Eve (India Eisley), die während ihres Tiefschlafs geboren wurde und von deren Existenz sie nichts geahnt hatte. Die wenigen verbliebenen Vampire und Lykaner haben sich im Untergrund verschanzt, die verstoßene Selene kann aber nur auf die Unterstützung des jungen Vampirs David (Theo James) bauen.